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qPCR 和 dPCR 區別,以及各自的最佳應用

PCR 擴增 DNA 是實驗室中常用的基礎技術,隨著技術的發展,其應用范圍不斷擴展,包括臨床檢測。定量 PCR (qPCR) 是一種可靠的已建立的方法,允許對靶 DNA 進行相對定量,例如基于 PCR 的冠狀病毒測試使用 qPCR。相比之下,數字 PCR (dPCR) 或液滴數字 PCR (ddPCR) 使用類似的化學方法檢測 DNA 序列,但在許多微小體積或液滴中進行檢測,利用數學的力量提高信噪比。


雖然 qPCR 和 dPCR 有很多相似之處和不同之處,但在與 PCR 專家交談時,有幾個重要的品質更加突出。隨著時間的推移,PCR 技術在不斷發展,因此這些品質也可能會隨之改變。本文旨在討論當今 qPCR 和 dPCR 技術之間的一些重要區別,以及它們在不同領域的最佳應用。


01

靈敏度,以及絕對與相對定量


多年來,定量 PCR 一直是許多應用的黃金標準。然而,dPCR 能夠提供更靈敏的測量和目標 DNA 的絕對定量(相對于 qPCR 的相對定量)。"使用 qPCR,科學家只能通過將結果與標準曲線進行比較來確定樣本中的核酸濃度,"生物制藥部門經理 Marwan Alsarraj 解釋道。"另一方面,ddPCR 直接量化核酸,因此對小核酸濃度更敏感,使工具更準確。"


這使得 dPCR 非常適合于目標存在于復雜樣本中的應用,例如分析來自液體活檢的循環腫瘤 DNA。"隨著目標分子變得越來越少,檢測和精確量化這些分子變得越來越具有挑戰性," dPCR 高級總監兼總經理 Paul Hung 說道。"由于 dPCR 自然稀釋了許多反應中的分子,因此當給定目標存在于高濃度的非目標分子中時,可以提高靈敏度。"盡管如此,qPCR 仍然是許多應用的首選方法,因為其速度更快,更易于使用,并且可以在更大的樣本集中進行相對定量。

02

在實驗室和診所中越來越多地使用 dPCR


dPCR 的靈敏度提高使得研究實驗室和診所都受益?!半S著細胞和基因治療研究和開發的不斷發展,開發人員越來越多地轉向 dPCR 來精確測量不同的目標,包括工程病毒載體、基因編輯事件、質粒和完整衣殼,”Paul Hung 表示。


在臨床領域,如腫瘤學和器官移植等方面,dPCR 檢測稀有 DNA 的能力以及量化稀有 DNA 中微小但有顯著的倍數變化,也受到了青睞。例如,dPCR 被用于檢測癌癥患者的循環腫瘤 DNA,并評估細胞和基因治療的正確劑量?!半S著精準醫學變得越來越主流,我們預計 ddPCR 將在臨床中變得更加普遍,因為 ddPCR 可以檢測腫瘤負荷響應癌癥治療的微小變化,”Marwan Alsarraj 表示?!袄?,使用 ddPCR 進行連續監測可以使腫瘤學家識別治療后有復發風險的患者?!比欢?,在某些情況下,qPCR仍然是臨床應用的首選方法,因為它更快速,更易于使用,并且可以在更大的樣本集中進行相對定量。


03

動態范圍和靈活性


盡管 dPCR 在靈敏度方面表現出色,但在許多其他應用中,qPCR 仍然是最佳選擇。"我們建議我們的客戶在基因表達中使用 qPCR,因為它的動態范圍很廣;其量化不同表達水平、區分剪接變體和多重分析的能力;及其高通量應用和自動化的能力," Marwan Alsarraj 表示。實際上,在實驗室和監管環境中,qPCR 更為廣泛應用,并且被廣泛用于基因、健康狀況或傳染病的篩查。


在分析大量樣本時,qPCR 可能比 dPCR 更為經濟實惠。"qPCR 本質上是一種靈活且具有成本效益的技術,可滿足許多研究需求,使研究人員能夠選擇適合其特定需求的耗材,包括多種反應化學、分析選項和易于互換的塑料," Paul Hung 表示。"在生物制藥行業,qPCR 被用于單克隆抗體、疫苗、細胞和基因治療以及生物仿制藥的制造過程中,作為質量控制和基因分析的工具。"


隨著不斷的創新和廣泛的使用,qPCR 的應用只會擴大。"科學家們不斷發現使用 qPCR 的新方法,因為它已經從基因表達擴展到制造和診斷的過程測試,"Alsarraj 表示。"我們希望隨著技術核心應用的成熟,創新將繼續下去。"


04

多重應用的進展

盡管 qPCR 曾經在多重檢測方面具有優勢,但數字 PCR(dPCR)正在迅速成為發展更高的多重檢測功能的平臺。例如,Stilla Technologies 的 naica ®系統等平臺可以運行 30 重或更多的 dPCR 反應?!耙恍┛蛻艨梢栽?naica ®系統上運行與在 qPCR 儀器上相同的分析,但他們只運行一次樣品并獲得絕對定量,而不是依賴標準曲線并不得不重復運行他們的樣品,”Stilla Technologies 全球營銷和商業運營副總裁 Matthew Grow 表示?!霸?naica ®系統為研究人員提供了查看擴增和檢測效率的能力,一直到單個液滴的水平,每個 PCR 反應在他們珍貴的樣本中并行發生?!?/span>


隨著 dPCR 能夠檢測稀有基因表達或癌癥相關的拷貝數變異事件,更多的多路復用可能會揭示更多未來使用的途徑?!岸嘀?dPCR 是對當前下一代測序技術的出色補充,可以讓醫院實驗室有機會進行更多的內部患者檢測,而不必與外包或集中式實驗室合作,”Matthew Grow 指出。


盡管如此,qPCR 和 dPCR 可能會繼續以互補關系存在?!拔覀円呀浛吹?qPCR 對于監測和管理 COVID-19 大流行的重要性,它將仍然是臨床測試實驗室、分析開發人員和生物技術行業的重要工具,”Paul Hung 表示?!半S著 dPCR 技術通過簡化的工作流程和更快的回答時間變得更容易獲得,它將在需要穩健、可靠和精確量化的用例中得到采用。因此,兩種技術將繼續在不同的應用場景中發揮各自的優勢?!?
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